1 .接種5 mL含有酵母攜帶的質粒的YDP培養(yǎng)液,將其在30振蕩培養(yǎng)16-24小時,。
2 .采集酵母培養(yǎng)菌體1-3 mL (使用2107細胞),,室溫下離心5000g 5min。
3 .棄去培養(yǎng)液,,收集菌體,,加入480L Buffer SE和30L Lyticase solution。 最快上浮1min,。 充分懸浮細胞粒子,,有助于提高獲得率。 將其置于30消化30min左右,。
注:請確認已將-mercaptoethanol添加到bufferse(10L/mL )中后再使用。 這個混合液在室溫下可以很好地放置的時間是1周,。
4 .將混合液顆粒在室溫4,,4000 XG下離心5min,完全棄去上清,。
加入5.250 l bufferypi使混合液粒子再懸浮,。
6 .加入玻璃珠50 mg,最快轉彎5min,,玻璃珠使樣品沉降穩(wěn)定,。 將上清轉移到1.5ml的離心管中。
加入7.250 l bufferypii,,將離心管逆混合4-6次,,得到干凈的溶解物。 將其在室溫下放置5 min,。
注:此步驟應避免高強度混合,,因為染色體DNA斷裂,質粒純度降低,。 YPII在保存時必須蓋好蓋子,。
8 .加入8.350Lbufferypiii,用手將試樣倒置,,攪拌至形成絮凝物白色沉淀,。 室溫下13,000g離心10min,。
9 .小心轉移干凈上清至DNA Mini Column,,取上清時盡量不干擾顆粒和沉淀。 在室溫下以10,000g離心30s,。 傾倒廢液,,將吸附柱再次插入收集管。
10 .吸附柱裝500L buffer kb,,以12,,000r pm離心30秒,棄去彎管和廢液,。
11 .將吸附柱放入新的收集管,,加入650L洗滌緩沖液(確保有乙醇),離心12,,000秒,,棄去廢液,將吸附柱重新插入收集管,。
注: Wash Buffer用無水乙醇稀釋后使用,。
12 .可選步驟:重復步驟11。
13.13,,000r pm開蓋離心2分鐘,。
注:開蓋離心有助于去除殘留乙醇,乙醇的有效去除可保證DNA的洗脫,。
14 .在新的1.5ml離心管中放入柱子,,在柱子中放入50-100 lelutionbuffer (10 mm tris-HCl,pH 8.5 ),,室溫
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